掃描電鏡（SEM）對生物樣品進行低溫成像是一種常見的技術，用于觀察生物樣品在接近其自然狀態下的形貌，減少樣品在電鏡下的損傷和失真。生物樣品由于含水量較高，傳統的SEM成像過程中通常會遭遇樣品表面蒸發、變形或燒蝕等問題。低溫成像可以有效減緩這些問題。下面是如何進行低溫成像的一些關鍵步驟和技術要點：

1. 冷凍準備與樣品制備

快速冷凍（Cryofixation）：樣品需要經過快速冷凍處理，以便在樣品內保持其天然結構。常見的快速冷凍方法包括：液氮冷凍：將生物樣品迅速浸入液氮中（-196°C），達到幾乎瞬時冷凍，防止水分結冰時對細胞結構的損傷。

冷凍噴霧法：在低溫下，通過噴霧冷卻樣品的表面。

高壓冷凍：通過在高壓下進行冷凍（通常高達2000 bar）來防止水分在細胞內部形成冰晶，從而減少細胞結構損傷。

冷凍保存（Cryopreservation）：在冷凍后，樣品可以在低溫下長期保存，避免樣品的自然衰退。需要注意樣品冷凍后是否能夠保持生物活性。

2. 冷凍斷層掃描（Cryo-SEM）

原理：冷凍斷層掃描（Cryo-SEM）是一種結合冷凍和掃描電鏡的技術，用于觀察低溫下的生物樣品。冷凍樣品在低溫下保持其自然狀態，樣品在掃描電鏡下通常會在低溫下維持在液氮溫度附近，避免水分揮發。

設備要求：需要具備專門的低溫樣品室或冷凍舞臺的掃描電鏡。設備通常包含一個低溫樣品臺，樣品臺的溫度可以在-150°C到-180°C之間調節。

3. 真空環境與低溫穩定性

低溫真空環境：SEM使用高真空環境，這可能會導致冷凍樣品中的冰晶升華。為了減少這種影響，可以通過在低溫環境下操作（如液氮溫度下）來降低升華速率，保持樣品的低溫狀態。

低溫電子束影響：在低溫下，電子束的影響可能與常規環境下有所不同。電子束與樣品的相互作用較弱，這有助于避免樣品的熱損傷和其他結構破壞。

4. 樣品涂層（Coating）

低溫下的涂層問題：傳統的SEM成像需要給生物樣品涂上一層金屬導電層（如金或鉑），以避免充電效應。然而，低溫下，金屬涂層可能與樣品的低溫特性相沖突。因此，采用非導電涂層（如碳涂層）或使用低溫穩定的金屬涂層可以避免對低溫下的樣品產生影響。

低溫涂層技術：有些冷凍電鏡設備具備低溫涂層功能，能夠在低溫環境下進行涂層，避免樣品溫度升高。

5. 圖像獲取與分析

圖像清晰度：低溫環境下，樣品表面不會發生水分揮發和形態扭曲，從而獲得更清晰、更細致的結構信息。通常情況下，低溫下的圖像質量較好，能夠保持生物組織的細節和形態特征。

圖像增強：冷凍樣品表面未蒸發的水分有助于更好地觀察樣品的表面結構，尤其是對于一些含水量較高的細胞或組織樣品。冷凍態樣品可以提供更高的分辨率圖像。

6. 冷凍濺射（Cryo-SEM）中的濺射過程

濺射與冷凍：在進行低溫SEM成像時，濺射涂層會用非常細小的金屬顆粒（如鉑）覆蓋樣品表面。由于樣品處于低溫狀態，濺射層的附著力和導電性較好，能有效提高圖像質量。

7. 低溫掃描電鏡應用領域

生物醫學研究：低溫SEM可用于觀察細胞、組織、蛋白質復合物等生物樣品的表面結構。比如，觀察細胞膜的微結構、細胞之間的連接、細胞器等。

病毒研究：研究病毒的形態、結構以及病毒與宿主細胞的相互作用。

納米技術：研究納米粒子或納米材料與生物分子或細胞的相互作用，尤其在低溫環境下，能更真實地反映其生物學效應。

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